細胞(bao)培養技術注意事項(xiang)大匯(hui)總:

1. 實驗(yan)進(jin)行(xing)前，無(wu)菌(jun)室及無(wu)菌(jun)操(cao)(cao)作(zuo)(zuo)臺(laminar flow) 以(yi)紫外燈照射30-60 分鐘滅菌(jun)，以(yi)70 %ethanol 擦(ca)拭(shi)無(wu)菌(jun)操(cao)(cao)作(zuo)(zuo)抬面，并開(kai)啟無(wu)菌(jun)操(cao)(cao)作(zuo)(zuo)臺風扇運轉10 分鐘后(hou)，才開(kai)始(shi)實驗(yan)操(cao)(cao)作(zuo)(zuo)。每次操(cao)(cao)作(zuo)(zuo)只處理一(yi)(yi)株細(xi)胞株，且即使培養基相(xiang)同亦不(bu)共享培養基，以(yi)避免失誤混淆(xiao)或細(xi)胞間污染(ran)。實驗(yan)完畢后(hou)，將實驗(yan)物品帶出工作(zuo)(zuo)臺，以(yi)70 % ethanol 擦(ca)拭(shi)無(wu)菌(jun)操(cao)(cao)作(zuo)(zuo)抬面。操(cao)(cao)作(zuo)(zuo)間隔(ge)應讓無(wu)菌(jun)操(cao)(cao)作(zuo)(zuo)臺運轉10 分鐘以(yi)上(shang)后(hou)，再進(jin)行(xing)下一(yi)(yi)個細(xi)胞株之操(cao)(cao)作(zuo)(zuo)。

2. 無菌操(cao)(cao)作工作區(qu)域應(ying)保持(chi)清潔及寬敞，必要物品，例(li)如試管架、吸管吸取器或(huo)吸管盒等可以暫時放(fang)置，其它實(shi)(shi)驗用品用完(wan)即應(ying)移出(chu)，以利于氣流之流通。實(shi)(shi)驗用品以 70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操(cao)(cao)作臺內。實(shi)(shi)驗操(cao)(cao)作應(ying)在(zai)(zai)抬面之中央無菌區(qu)域，勿在(zai)(zai)邊緣之非無菌區(qu)域操(cao)(cao)作。

3. 小心(xin)取(qu)用無菌之(zhi)實(shi)驗(yan)物品，避免造(zao)成(cheng)污染。勿(wu)碰觸吸管尖(jian)頭部(bu)或容(rong)器(qi)瓶口(kou)，亦不要在打開之(zhi)容(rong)器(qi)正上方操作實(shi)驗(yan)。容(rong)器(qi)打開后(hou)，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角(jiao)取(qu)用，盡量勿(wu)將瓶蓋蓋口(kou)朝上放置桌面(mian)。

4. 工(gong)作(zuo)人員應(ying)注意(yi)自身(shen)之(zhi)(zhi)安全，須穿(chuan)戴(dai)實驗(yan)衣及手套后才進行實驗(yan)。對于來自人類或(huo)是病毒感(gan)染之(zhi)(zhi)細胞(bao)株應(ying)特(te)別(bie)小心(xin)操作(zuo)，并選擇(ze)適當等級之(zhi)(zhi)無菌操作(zuo)臺(至少(shao) Class II)。操作(zuo)過程中，應(ying)避(bi)免(mian)引起aerosol 之(zhi)(zhi)產生(sheng)，小心(xin)毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避(bi)免(mian)尖銳(rui)針頭之(zhi)(zhi)傷害等。

5. 定(ding)期(qi)(qi)檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶(ping)之(zhi)CO2壓力(li) 5.2. CO2 培養箱之(zhi)CO2濃(nong)度、溫度、及水(shui)盤是否有(you)污染(水(shui)盤的(de)水(shui)用無菌水(shui)，每(mei)周更換(huan))。 5.3. 無菌操作臺內之(zhi)airflow 壓力(li)，定(ding)期(qi)(qi)更換(huan)紫(zi)外(wai)線燈管及HEPA 過(guo)濾膜(mo)，預濾網(wang)(wang)(300小時/預濾網(wang)(wang)，3000 小時/HEPA)。

6. 水(shui)槽(cao)(cao)可添(tian)加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水(shui)槽(cao)(cao)的(de)水(shui)。

7. 認真(zhen)按照操作規(gui)程進行實驗，一般不大會導(dao)致污染，很多情況(kuang)下(xia)是由于所用的試(shi)劑或培養基(ji)有污染而使實驗失敗。

8. 粉末培養基配(pei)制好(hao)后(hou)(加了(le)血(xue)清)，一般在(zai)4度(du)盡量不(bu)要超(chao)過1個月，如在(zai)-20度(du)存(cun)放(fang)時(shi)間可長一些，但最(zui)好(hao)也不(bu)要超(chao)過3-4個月，可能對(dui)于永(yong)生化細(xi)胞株(zhu)來說要求不(bu)是太(tai)高(gao)，但我在(zai)過去的4年里一直是作原代 細(xi)胞培養 的，細(xi)胞嬌弱，經(jing)驗(yan)表明放(fang)置時(shi)間不(bu)宜過長。

9. 關(guan)于(yu)實驗用品的清(qing)(qing)洗(xi)(xi)(xi)與消(xiao)毒(du)，我的經驗是：用過(guo)的玻璃器皿先在清(qing)(qing)水中浸泡30min以上，然后加(jia)少許清(qing)(qing)洗(xi)(xi)(xi)劑，以超(chao)聲波洗(xi)(xi)(xi)滌30min左右，(如無超(chao)聲波洗(xi)(xi)(xi)滌器可(ke)用軟毛(mao)刷(shua)輕輕刷(shua)洗(xi)(xi)(xi)干凈)，撈出(chu)晾(liang)(liang)干，再在鉻酸洗(xi)(xi)(xi)液(ye)中浸泡6-18h(或過(guo)夜)后，自來(lai)水清(qing)(qing)洗(xi)(xi)(xi)10-15遍，雙(shuang)蒸(zheng)水清(qing)(qing)洗(xi)(xi)(xi)3-4遍，晾(liang)(liang)干，高壓消(xiao)毒(du)后即可(ke)使(shi)用。

10. 許多(duo)塑料(liao)制品(pin)也可(ke)(ke)以高壓(ya)消毒(du)，例如(ru)(ru)培養(yang)瓶蓋，膠塞，吸頭等。不(bu)能(neng)用(yong)于高壓(ya)的一般均已(yi)制成一次性(xing)作用(yong)的商品(pin)了，當然如(ru)(ru)果 money有(you)限，如(ru)(ru)進(jin)口的培養(yang)板、皿等，也可(ke)(ke)以重復(fu)(fu)使(shi)用(yong)1-2次，我當時使(shi)用(yong)方法是將其清潔后，使(shi)用(yong)前在紫外(wai)燈(deng)下敞開照射1-1.5h即可(ke)(ke)，我做過多(duo)次，沒有(you)出(chu)現問(wen)題。塑料(liao)培養(yang)瓶由于清洗(xi)消毒(du)不(bu)便，最好不(bu)要(yao)重復(fu)(fu)使(shi)用(yong)，如(ru)(ru)一定要(yao)重復(fu)(fu)用(yong)，可(ke)(ke)用(yong)環氧乙烷等消毒(du)，(消毒(du)后一定要(yao)放置半年以上方可(ke)(ke)使(shi)用(yong))。

11. 在光鏡下，上(shang)皮細(xi)胞通(tong)常呈“鋪路石"樣排布，細(xi)胞之(zhi)間有拉絲(si)現象(即距離較(jiao)遠(yuan)的(de)(de)(de)細(xi)胞可以通(tong)過細(xi)長(chang)(chang)(chang)的(de)(de)(de)觸手相連)，細(xi)胞有成片(pian)生(sheng)長(chang)(chang)(chang)的(de)(de)(de)特性。而間質細(xi)胞通(tong)常呈梭(suo)形(xing)，沒有有成片(pian)生(sheng)長(chang)(chang)(chang)的(de)(de)(de)特性，細(xi)胞之(zhi)間的(de)(de)(de)聯系不(bu)緊密。但(dan)是細(xi)胞的(de)(de)(de)形(xing)態特征會(hui)(hui)因(yin)為(wei)(wei)生(sheng)長(chang)(chang)(chang)條(tiao)件(jian)的(de)(de)(de)改(gai)變而改(gai)變，如HeLa細(xi)胞是上(shang)皮細(xi)胞，但(dan)是在酸性培養條(tiao)件(jian)下會(hui)(hui)變為(wei)(wei)梭(suo)形(xing)。